Рассказы о биоэнергетике - Скулачев Владимир Петрович - Страница 24

Известно, что мочевина нарушает многочисленные временные связи, возникающие внутри белков и между белками. Если «гриб» держится за мембрану за счет таких связей, есть шанс, что мочевина не разрушает «грибы», а просто отделяет их от мембраны. Тщательный просмотр микрофотографий убедил Ракера, что в растворе, где находились фрагменты митохондрий, после добавления мочевины появляются сферические частицы диаметром около 85 ангстрем. Центрифугирование всей этой смеси в течение часа при ускорении, в 100 тысяч раз превышающем силу земного тяготения, привело к ее разделению на осадок (в нем были фрагменты мембран) и надосадочную жидкость, содержавшую сферические частицы. Их удалось осадить добавлением соли.

Так в руках Ракера оказалась чистая фракция «грибов». Как показали последующие опыты, «грибы» с большой скоростью расщепляли АТФ до АДФ и фосфата. Более того, добавив «грибы» к обработанным мочевиной мембранам, ученый обнаружил, что на мембране вновь появились грибовидные выросты. При этом возвратилась способность к синтезу АТФ, сопряженному с дыханием.

Определение массы «гриба» показало, что она порядка 385 килодальтон, или в 385 тысяч раз больше массы атома водорода. «Гриб» оказался составленным из нескольких индивидуальных белков с массами от 10 до 55 килодальтон. Еще несколько белков с общей массой порядка 100 килодальтон было обнаружено в мембранной части протонной АТФ-синтетазы. Эти последние нужны для прикрепления «гриба» к мембране и переноса протонов через мембрану. Таким образом, суммарная масса одной молекулы митохондриальной АТФ-синтетазы оказалась чуть меньше 500 килодальтон.

Как же работает этот довольно сложный и внушительный по молекулярным масштабам агрегат?

Рассмотрим сначала реакцию, когда расщепление АТФ ведет к генерации протонного потенциала. Простой опыт показывает, что АТФ взаимодействует первоначально с «грибом», а не с мембранным сектором белкового генератора. Если к митохондриям добавить АТФ, то он не расщепится, пока не пройдет через мембрану и не окажется внутри митохондрии, куда обращены грибовидные выросты.

Ясно также, что гидролиз АТФ происходит в «грибах», поскольку белки мембранного сектора с АТФ не взаимодействуют. Зато они способны к переносу протонов. Эта их активность может быть продемонстрирована, так сказать, в чистом виде на мембранах, лишенных «грибов». Такие мембраны свободно пропускают ионы Н+, причем добавление «грибов» блокирует эту протонную проводимость. Можно нарушить проводимость другим путем — добавлением олигомицина. Кроме того, этот антибиотик прекращает как синтез, так и гидролиз АТФ в исходных мембранах, но не влияет на гидролиз АТФ «грибами», отделенными от мембраны.

По-видимому, мембранные белки АТФ-синтетазы образуют проводящий протоны канал, который связывает «гриб» с противоположной (наружной) стороной мембраны митохондрии. «Гриб», как пробка в графине, закрывает выход из канала на внутренней стороне мембраны. После удаления «гриба» канал становится сквозным, связывая между собой вне- и внутримитохондриальные пространства. Олигомицин нарушает работу канала.

Если «гриб» отделен от мембраны и свободно плавает в воде, то гидролиз АТФ не может привести к созданию протонного потенциала просто из-за отсутствия мембраны, разделяющей пространство на два изолированных отсека.

Если «гриб» прикреплен к мембране и состыкован с каналом, то гидролиз АТФ сопровождается переносом протонов из митохондрии наружу.

Проще всего этот процесс можно представить себе следующим образом. Внутри митохондрий АТФ связывается с «грибом», переносится куда-то в глубь мембраны и там расщепляется на анионы АДФ и фосфата (АДРО- и -ОР):

АДРОР + Н2O → АДРО- + -ОР + 2Н+, где АТФ обозначен как АДРОР.

Затем ионы Н+ выделяются в канал и выходят наружу, а АДРО- и -ОР переносятся внутрь митохондрии и там связывают протоны:

АДРО- + -ОР + 2Н+внутр. → АДРОН + НОР.

Процесс в целом описывается уравнением: АДРОР + 2Н2O + 2Н+внутр. → =АДРОН + НОР + 2Н+наружн.

Реакция гидролиза АТФ сопровождается выделением энергии. Поэтому сопряженный с ней перенос ионов Н+ изнутри митохондрий наружу получает возможность идти в энергетически невыгодном направлении, создавая внутри нехватку ионов Н+ и положительных зарядов. Эта нехватка должна возрастать по мере того, как все новые молекулы АТФ гидролизуются митохондрией.

Значит, чем дольше работает АТФазный генератор, тем труднее ему переносить ионы Н+ через мембрану. В конце концов генератор выключится вовсе. Это произойдет в момент, когда выигрыш в энергии от гидролиза уравняется с проигрышем в энергии, сопутствующим переносу ионов Н+ против электрического поля из отсека, где ионы Н+ в дефиците, в отсек, где они в избытке.

Если теперь включить какой-нибудь другой протонный генератор, откачивающий ионы Н+ из митохондрий, например, за счет энергии дыхания, то митохондриям окажется выгоднее впускать внутрь ионы Н+, синтезируя АТФ, чем выталкивать ионы, гидролизуя АТФ. Другими словами, итоговая реакция, приведенная выше, изменит направление и потечет справа налево. Гидролиз АТФ сменится его синтезом, то есть возникнет процесс дыхательного фосфорилирования.

Таковы общие черты устройства протонной АТФ-синтетазы. Однако существенные детали этого механизма все еще остаются неясными, затрудняя выбор между несколькими возможными схемами, призванными описать принцип его работы.

Один из ключевых вопросов — это как, каким способом АТФ, АДФ и фосфат переносятся из водной фазы митохондрии в гидрофобную фазу митохондриальной мембраны, чтобы попасть в сферу действия электрического поля?

АТФ, АДФ и фосфат — это весьма гидрофильные многозарядные анионы. Их сродство к воде очень велико, а к липиду — ничтожно. Чтобы помочь этим веществам перейти из воды внутрь мембраны, необходимо какое-то специальное приспособление. Что бы это могло быть?

Помня, каким скользким может быть путь аналогий, мы тем не менее рискнем обратиться к другой белковой системе, также присутствующей в митохондриальной мембране и имеющей дело с АТФ и АДФ. Я имею в виду так называемый АТФ/АДФ-антипортер.

М. Клингенбергом был получен в чистом виде и подробно исследован мембранный белок массой 30 кило-дальтон, способный обменивать содержащийся в митохондриях АТФ на внемитохондриальный АДФ (этот процесс обозначается термином «антипорт»). Выяснилось, что у антипортера есть два места связывания АТФ и АДФ. Белок закреплен в мембране таким образом, что эти два места обращены в воду по разные стороны мембраны. Если к белку на внутренней поверхности мембраны присоединяется АТФ, а на внешней — АДФ, то молекула белка поворачивается на 180 градусов или совершает какое-то более сложное движение, в результате которого участок белка с АТФ появляется снаружи митохондрии, а участок с АДФ - внутри.

Поворот в обратном направлении затрудняется электрическим полем, генерируемым на мембране митохондрий за счет дыхания. Дело в том, что АТФ несет на себе четыре отрицательных заряда, а АДФ — только три. Обмен наружного АТФ4- на внутренний АДФ3- означал бы перенос внутрь митохондрии отрицательного заряда против электрического поля. В то же время обратный процесс должен идти по полю, которое может быть движущей силой такого обмена.

Мой коллега И. Козлов выдвинул предположение, что та часть АТФ-синтетазы, которая имеет дело с АТФ, АДФ и фосфатом, устроена по принципу АТФ/АДФ-антипортера.

Предполагается, что в АТФ-синтетазе есть два места связывания субстратов реакции. Одно из них обращено в водное пространство внутри митохондрии, другое погружено в мембрану.

Согласно гипотезе при синтезе АТФ происходит антипорт АТФ4-/(АДФ3- + РО43-) между двумя местами связывания. Если рассчитать суммарный баланс переносимых при таком антипорте заряженных групп, то окажется, что из воды внутрь мембраны перенесены два отрицательных заряда. Электрическое поле, генерируемое на мембране дыхательными ферментами (минус внутри митохондрий), способствует антипорту АТФ4-/(АДФ3- + РО43-): поле должно удалять АТФ из внутримембранного места связывания, заменяя АТФ на АДФ и фосфат.