Рассказы о биоэнергетике - Скулачев Владимир Петрович - Страница 19

Окончив физфак МГУ, он занялся ионосферой, а потом лазерами. Нас познакомил Либерман. Он же сагитировал Драчева включиться в биоэлектрическую эпопею. С легкой руки ректора МГУ Р. Хохлова Драчев стал сотрудником нашей лаборатории.

Услышав истории о проникающих ионах, протеолипосомах и прочих премудростях биоэнергетики, Драчев флегматично заметил, что электричество, если его действительно генерируют мембранные белки, хорошо бы мерить вольтметром и амперметром.

Мы сами знали, что хорошо бы, и потому не сочли мнение Драчева за снобизм чужака-физика. Проникающие ионы, электрохромизм в опытах Витта или открытые позже флуоресцентные красители, реагирующие на Δψ, — это все же косвенные методы. А в столь сложной системе, как биологическая, одно прямое измерение стоит сотен косвенных. Например, такое чуждое для живой клетки вещество, как ТФБ-, совершенно неожиданно оказалось восстановителем для одного из ферментов в хлоропластах. А ведь ТФБ- считали биологически инертным соединением! Так что мы сразу согласились с Драчевым.

Однако как прямо измерить производство электричества белками? Вводить микроэлектрод в митохондрию? Но она слишком сложна.

Мое воображение уже было отравлено гениальной простотой протеолипосом. Микроэлектрод в протеолипосому? Так ведь она всего 0,1 микрона в диаметре!

Нет, это не путь. А если включить белок — генератор тока в черную искусственную мембрану? Тогда бы мы измерили разность потенциалов и ток обычными электродами, помещенными в растворы по обе стороны от перегородки, отверстие в которой закрыто мембраной. Но как включить белок в черную мембрану?

Белки, генераторы электричества, как и другие мембранные белки, в воде нерастворимы. Попробуем добавить их к раствору фосфолипидов в декане, который применяют обычно для образования черной мембраны. А какой взять белок?

Конечно, тот, что может использовать энергию света! Добавлять растворы окисляемых веществ или АТФ в таком опыте неудобно: черная мембрана вообще непрочна. Это, по существу, оболочка мыльного пузыря. Да еще белковые включения, которые, вероятно, прочности мембране не прибавят! Капля любого раствора может ее разрушить. Свет, безусловно, удобнее.

Итак, должен быть какой-то из белков, участвующий в усвоении энергии света, то есть в фотосинтезе.

Как раз в это время У. Стокениус и Д. Остерхельтв США описали новый тип светочувствительных белков бактериородопсин. Как выяснилось, у солелюбивых бактерий есть фиолетового цвета белок, содержащий, подобно зрительному пурпуру глаза — родопсину, — производное витамина А — ретиналь. Было получено косвенное указание на то, что бактериородопсин может переносить через мембрану водородные ионы за счет энергии света, заменяя содержащие хлорофилл белки обычных организмов-фотосинтетиков.

В конце 1973 года академик Ю. Овчинников организовал проект «Родопсин» для сравнительного исследования животного и бактериального пигментов. Мы занялись изучением бактериородопсина, используя препарат, полученный в Институте биофизики Л. Чекулаевой, тогда сотрудницей лаборатории Л. Каюшина. Были приготовлены протеолипосомы с бактериородопсином в качестве белка. Затем методом проникающих ионов была доказана способность бактериодопсина превращать свет в разность электрических потенциалов.

Я хорошо помню эти опыты. Особенно удачно они шли по воскресеньям, когда в опустевшей лаборатории никто не ходил мимо прибора и тончайшая фосфолипидная мембрана, измеряющая концентрацию ФКБ-, стояла, не лопаясь, в течение нескольких часов кряду. Я включал и выключал свет, наслаждаясь стабильностью и воспроизводимостью обнаруженного явления. Бактериородопсин работал как часы: протеолипсомы безотказно поглощали анионы (ФКБ-) в ответ на свет и отдавали их в среду в ответ на «тьму». Приходя после опыта домой, я развешивал ленты самописца по стенам, чтобы полюбоваться ими на сон грядущий.

Бактериородопсин оказался действительно на редкость стабильным генератором протонного потенциала. Эту его способность не могло убить нагревание до 100 градусов, помещение в 0,1 N кислоту и, как мы выяснили вместе с сотрудниками Овчинникова, даже расщепление белка в трех местах протеолитическим ферментом. Поэтому неудивительно, что было решено попытать счастья с прямым измерением разности потенциалов, используя именно бактериородопсин. План был прост: добавить бактериородопсин к смеси для приготовления черной мембраны и посмотреть, не приведет ли освещение такой мембраны к генерации тока.

Никогда не прощу своим товарищам, что они не позвали меня к прибору, когда впервые осветили мембрану с бактериородопсином. Осторожный Драчев, улыбаясь и пощипывая бородку, сообщил мне о генерации фототока лишь на следующий день.

Так в прямом опыте была доказана способность индивидуального белка превращать энергию света в электричество.

Суп из топора

Справедливости ради надо сказать, что разность потенциалов, генерируемая на свету, в первом опыте Л. Драчева не превышала 20 милливольт. Это примерно в 12 раз меньше величины, необходимой для энергообеспечения процесса фосфорилирования. Причиной, вызвавшей резкое занижение фотопотенциала, был двоякий характер ориентации бактериородопсина в черной мембране: часть молекул белка генерировала ток одного направления, а другая часть - противоположного. Это и неудивительно, ведь черная мембрана симметрична, и в идеале фотопотенциал не должен был образовываться вовсе. Если все же его удалось обнаружить, то лишь из-за небольшого случайного превышения количества белка, встроившегося, скажем, с левой стороны мембраны, над белком с правой ее стороны.

Как же упорядочить ориентацию бактериородопсина в искусственной мембране? Первоначально мы не знали даже, с какого конца подступиться к проблеме. Но нам повезло: решение вскоре было найдено совершенно случайно.

Как-то наш молодой сотрудник А. Семенов ставил опыт с протеолипосомами, поглощавшими на свету проникающие анионы ФКБ-. Варьируя состав раствора с протеолипосомами, он добавил в смесь сульфат магния. Никаких изменений добавка не вызвала, и Семенов совсем было собрался прекратить эксперимент, но в этот момент в лабораторию зашел кто-то из его знакомых.

За приятной беседой сотрудник забыл о своем намерении сменить не оправдавшую его ожиданий пробу и вновь включил свет. К своему удивлению, он обнаружил, что теперь свет вызывает заметно больший эффект, чем десять минут назад. Семенов включил свет еще раз и, убедившись, что явление не исчезло, отправился на поиски шефа, чтобы похвалиться своим маленьким открытием. На эти поиски ушло еще четверть часа.

— Смотрите, как вырос фотоэффект, — сказал он и вновь включил свет.

Перо самописца резко метнулось к краю измерительной шкалы и, пока мы обалдело следили за поистине циклопическим фотоэффектом, застряло в краевой перфорации ленты и начало рвать бумагу в напрасных попытках продвинуться дальше. Я быстро освободил перо из плена, а Семенов переключил шкалу вольтметра с 10 на 100 милливольт.

На сей раз фотоэффект удалось записать. Это был огромный потенциал, который рос на глазах. Так продолжалось еще около часа, после чего лопнула черная мембрана, использовавшаяся в этом опыте для измерения концентрации анионов ФКБ-. Мы поставили новую мембрану и на всякий случай еще раз загрубили шкалу, полагая, что за время установки мембраны эффект еще более возрос.

Включили свет - перо вздрогнуло и отползло, словно нехотя, на два миллиметра в сторону. Повторное освещение дало тот же жалкий результат. Немедленно у прибора был созван консилиум лучших умов лаборатории, находившихся в пределах досягаемости. Пока судили да рядили, как объяснить только что наблюдавшийся и внезапно утраченный гигантский фотоэффект, прошло какое-то время, и Семенов для очистки совести еще разок осветил ячейку с протеолипосомами.

- Смотрите! Он вернулся! - услышали мы у себя за спиной торжествующий возглас.

И правда, эффект-богатырь возник вновь. Налицо было какое-то медленно развивающееся явление, исчезавшее всякий раз, когда мы заменяли одну измерительную мембрану другой. Стало быть, измерительная мембрана, а вовсе не протеолипосомы, подвергалась действию сульфата магния.