Полный справочник медицинской аппаратуры - Коллектив авторов - Страница 40

Введя в эту формулу значения объема одного большого квадрата, получим:

X = а х 20/100 х (4 х 10-3) = а х 20/400 х 10-3 = а х 50/мкл.

Таким образом, количество лейкоцитов в 1 мкл равно числу клеток, посчитанных в 100 больших квадратах, умноженному на

50:

X = а х 50.

Пример: в 100 больших квадратах сосчитано 130 лейкоцитов. Тогда количество лейкоцитов в 1 мкл составит (130 х 50) = 6500, или 6,5 х 103/мкл. Учитывая, что в 1 мкл крови содержится 106 мкл, число посчитанных лейкоцитов можно выразить следующим образом: 6,5 х 109/л.

Поскольку подсчет количества форменных элементов в камере Горяева представляет собой весьма трудоемкое исследование, в клинической практике все чаще используют специальные автоматические счетчики клеток крови и гематологические автоматы, работа которых основана на разных принципах.

По механизму работы они все делятся на две большие группы: кондуктометрические, оптические с использованием в качестве источников света лазеров (проточные цитометры).

В основе работы кондуктометрических анализаторов лежит изменение электрического сопротивления. Определенное количество разведенной изотоническим раствором натрия хлорида или другим электролитом крови пропускают через микроотверстие. Проходящая клетка увеличивает сопротивление между электродами, возникающий импульс передается на счетное устройство с цифровой индикацией. Данная методика была предложена братьями Культер в 1947 г.

Однако если в один момент в канале находятся две клетки, то будет зарегистрирован только один импульс, что приведет к ошибке подсчета клеток. Во избежание таких ошибок, нужно развести пробу крови до такой концентрации клеток, при которой в канале датчика всегда будет не больше одной клетки.

Чтобы определить необходимую степень разведения цельной крови, нужно знать объем измерительного канала (V канала). Если в объеме измерительного канала в среднем находится одна клетка, то концентрация равна канала. Однако при этом вероятность того, что в канале могут находиться две и более клеток, достаточно велика. По законам математической статистики вероятность одновременного прохождения двух клеток через канал ничтожно мала, если концентрация клеток в 10 раз меньше, чем канала. При диаметре канала 80 мкм и длине 100 мкм получаем объем 0,5 мм3. Чтобы уменьшить концентрацию клеток цельной крови (5 000/мм3) до нужной величины, необходимо выполнить разведение в 5 000 х 0,5 х 10 = 25 000 раз.

Раздельное определение эритроцитов и тромбоцитов в современных анализаторах решается просто: тромбоциты (небольшие по размеру клетки) при прохождении измерительного канала генерируют электрические импульсы низкой амплитуды, а клетки большего размера – эритроциты – импульсы высокой амплитуды. Устройство, которое разделяет импульсы по величине амплитуды, – дискриминатор. В современных анализаторах применяются многоканальные дискриминаторы, позволяющие получить детальную информацию о размерах клеток в виде гистограмм, поскольку каждый канал соответствует определенному объему клеток. Выделив на гистограмме зону объемов клеток, соответствующих эритроцитам, и просуммировав данные, полученные по всем каналам, можно получить общее количество прошедших через датчик эритроцитов. Если при суммировании результатов подсчета эритроцитов значение каждого канала умножать на величину объема соответствующего канала, то получится величина суммарного объема, который занимают эритроциты – гематокрит. При делении гематокрита на концентрацию эритроцитов можно получить еще одну характеристику эритроцитов – средний объем.

Аналогичные показатели можно получить и для тромбоцитов: концентрацию тромбоцитов, тромбокрит, средний объем тромбоцитов.

Поскольку размеры лейкоцитов близки к размерам эритроцитов, их не удается разделить вышеописанным методом. При использовании кондуктометрических счетчиков в подсчет эритроцитов неизбежно будут вносить вклад лейкоциты. Однако за исключением явных лейкоцитозов их вклад будет ничтожно мал, так как в норме концентрация эритроцитов в крови на 3 порядка превышает концентрацию лейкоцитов. В то же время при определении концентрации лейкоцитов необходимость разрушения эритроцитов очевидна. Эта задача оказалась легко решаемой, так как свойства мембран эритроцитов и лейкоцитов существенно различаются. В частности, эритроциты легко лизируются под воздействием многих поверхностно-активных веществ, при этом лейкоциты, хотя и претерпевают некоторые изменения, но остаются целыми. Таким образом, при подсчете лейкоцитов, прежде чем пропустить разведенную суспензию крови через апертуру датчика, к ней добавляют раствор поверхностно-активного соединения (лизирующий раствор или гемолитик). Под действием гемолити-ка эритроциты разрушаются до очень мелких осколков, которые при подсчете лейкоцитов генерируют электрические импульсы очень низкой амплитуды, не влияющие на результат анализа.

Для гематологических анализаторов с дифференциацией лейкоцитарной тройки используется специальная композиция растворителя и гемолитика, в которой различные формы лейкоцитов претерпевают изменения размеров в разной степени и благодаря этому могут разделяться кондуктометрическим методом. Область малых объемов формируется лимфоцитами, которые под действием гемолитика значительно уменьшаются в объеме. Грануло-циты, напротив, расположены в области больших объемов. Между двумя пиками расположена зона так называемых «средних лейкоцитов», в которую попадают моноциты, базофилы, эозино-филы и плазматические клетки (см. рис. 7).

Все современные гематологические автоанализаторы измеряют и концентрацию гемоглобина, для чего у них имеется встроенный гемоглобинометр. При этом измерение концентрации гемоглобина происходит параллельно с определением концентрации лейкоцитов.

Оптические гематологические анализаторы в своей работе используют эффекты светорассеяния и флуоресценции, часто такие устройства называют проточными цитометрами. Измерение светорассеяния на клетках крови в проточных цитометрах производится в определенные телесные углы: 5°, 10°, 90°. Таким же образом измеряется деполяризация светорассеяния от клеток в 90°. Сочетание упомянутых сигналов светорассеяния применяется для дифференцировки лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, базо-филов, эозинофилов. Рассеяние в телесные углы 5° и 10° используют для измерения объема и концентрации гемоглобина эритроцитов. В измерительной камере устройства молекулы некоторых клеточных структур, пересекая луч монохромного лазера, поглощают свет определенной длины волны и переходят в возбужденное состояние. Через короткое время клетки возвращаются в исходное состояние, но при этом испускают кванты света с иными длинами волн. Это вторичное излучение, имеющее строго определенные для каждого вида клеток или их структур длины волн, проходит через оптическую систему прибора и регистрируется фотоэлектронным умножителем, который преобразует его в электрические сигналы, которые затем обрабатываются с помощью компьютера.

Физические свойства клеток (размер или цитоплазматическая гранулярность) могут быть измерены на любой отдельной неокрашенной клетке. Клетки также могут быть помечены специфическими красителями, окрашивающими ДНК, РНК или белок, или целым набором флюорохром-конъюгированных антител, направленных к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток.

Метод проточной цитометрии позволяет существенно увеличить объем информации, снимаемой с анализируемой частицы по светорассеянию. Только с использованием этой методики можно измерить индикатрису светорассеяния индивидуальной частицы. Индикатриса светорассеяния – это зависимость интенсивности рассеянного света от угла рассеяния. Причем диапазон измеряемых углов в проточных цитометрах составляет 5-120°. Технология проточной цитометрии включает в себя не только измерения индикатрисы светорассеяния, но и методы решения обратной задачи светорассеяния, т. е. методы, позволяющие получать информацию о морфологии клетки из индикатрисы светорассеяния. Таким образом, измерение и обработка индикатрис светорассеяния от клеток позволяют не только дифференцировать клетки крови, но и характеризовать эти клетки: определять их размер, форму, структуру, состав и т. д.