Респираторная медицина. Руководство (в 2-х томах) - Чучалин А. Г. - Страница 107

Чувствительность микоплазм к антимикробным препаратам определяют только в научных целях и при изучении новых препаратов. Как и хламидии они предсказуемо чувствительны к тетрациклинам, макролидам, кетолидам и фторхинолонам.

ДИАГНОСТИКА ВИРУСОВ

Для заражения вирусами используют разные культуры клеток, возникновение инфекции определяют по цитопатическому эффекту (ЦПЭ) или появлению гемагглютинирующих антигенов. Дополнительные тесты (гемадсорбции, ингибиции гемагглютинации, нейтрализации и иммунофлюоресценции) используют для дифференциации вирусов гриппа и парагриппа. Культуральный метод при изучении респираторных образцов более чувствительный, чем определение антигенов, и занимает в среднем 3 - 4 дня для обнаружения ЦПЭ при вирусе гриппа А и 8 -

9 дней при ЦМВ.

Выделение вирусов гриппа, парагриппа, РСВ и риновирусов из респираторных образцов и ткани легкого имеет одинаково важное клиническое значение, в отличие от аденовирусов, вирусов простого герпеса (ВПГ) и ЦМВ, обнаружение которых в респираторных образцах не столь существенно, как в ткани легкого.

type: dkli00089

СЕРОДИАГНОСТИКА

Серодиагностика основана на выявлении специфических антител (АТ) разных классов иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG) в сыворотке крови у инфицированных пациентов и определении их титров при однократном исследовании или в динамике заболевания (в парных сыворотках, взятых с интервалом 10 - 14 дней) с помощью антигенных диагностикумов в различных серологических реакциях in vitro. Обычно используются реакции преципитации, агглютинации, ВИЭФ, ИФА, непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), РСК. Эти методы имеют основное значение при подтверждении диагноза и проведении эпидемиологических исследований.

Известны коммерческие наборы на основе ИФА и РНИФ для определения IgM АТ и IgG АТ к широкому кругу респираторных патогенов: Legionella spp., Francisella tularensis, Yersinia pestis, M. pneumoniae, C. pneumoniae, C. psittaci, Coxiella burnetii, T oxoplasma gondii, Trichinella spiralis, Strongiloides stercoralis, вирусов гриппа, парагриппа, РСВ, аденовирусов, ТОРС-коронавирусов, ВПГ, ЦМВ, вирусов краснухи и оспы, Эпштейна - Барр.

Для диагностики инфекции, вызванной C. pneumoniae, обычно используется метод микроиммунофлюоресценция (МИФ). Результат считается положительным при четырехкратном увеличении титра АТ в парных сыворотках или при однократном определении титра IgM≥1:16 или IgG≥1:512 [49]. Аналогичные критерии применяются для C. psittaci. Чувствительность МИФ составляет 39 - 100%, специфичность - 94 - 100%, что превышает эти показатели в РСК и ИФА, применение которых при серодиагностике ИНДП хламидийной этиологии считается нецелесообразным [50]. При неонатальной пневмонии, вызванной C. trachomatis, титр видоспецифических IgM АТ 1:32 - диагностический и коррелирует с результатами культуральной диагностики. В то же время определение IgG малоинформативно из-за циркуляции у детей до 12 мес материнских АТ.

Ввиду низкой чувствительности культурального метода, серологические тесты составляют основу диагностики микоплазменной инфекции. Холодовые агглютинины (ХА), выявляемые в реакции агглютинации с резус-отрицательными эритроцитами 0(I) группы крови при 4 0;С, присутствуют приблизительно у 50% больных пневмонией, обусловленной M. pneumoniae. Их уровень приходит в норму через 6 нед после острой инфекции. Однако ХА могут образовываться при целом ряде вирусных инфекций, лимфомах, аутоиммунных нарушениях, что снижает их диагностическую ценность. Комплементсвязывающие АТ выявляют в РСК у 85% пациентов, что согласуется с результатами культурального метода. При этом важно четырехкратное нарастание титров АТ, либо титр ≥1:80 при однократном исследовании сыворотки. В последние годы получил развитие метод ИФА для выявления специфических микоплазменных IgM АТ и IgА АТ; его чувствительность и специфичность выше, чем РСК [50]. IgM АТ обнаруживают на 1-й неделе заболевания и достигают пика на 3-й неделе, у взрослых они продуцируются нерегулярно, поэтому отрицательный результат не исключает наличие инфекции. IgА АТ более постоянны, их продукция не зависит от возраста пациентов.

Серодиагностика грибковых инфекций не всегда информативна. Определение АТ к C. albicans не позволяет провести дифференциальную диагностику локализованного и диссеминированного кандидоза, так как эти АТ присутствуют и у больных и у здоровых пациентов и только в 50 - 75% наблюдений встречаются при диссеминированном кандидозе [40].

РСК для выявления АТ к B. dermatidis характеризуется низкой чувствительностью и специфичностью (25%), титр АТ может повышаться при инфекциях, вызванных C. immitis и H istoplasma capsulatum. Иммунодиффузионный тест для выявления АТ к B. dermatitidis более чувствительный и специфичный (40 - 70%), чем РСК. Однако и отрицательный результат не исключает диагноз бластомикоза.

При серодиагностике криптококкоза используют реакцию преципитации для определения IgM АТ, которые обнаруживают на 2 - 3-й неделе заболевания у 75% больных, затем постепенно исчезают [42]. Комплементсвязывающие IgG АТ появляются позднее, их титр 1:32 и выше предполагает возможность диссеминированной инфекции.

При легочном гистоплазмозе у 90% больных определяются АТ к H. capsulatum в РСК и методом иммунодиффузии, при диссеминированном процессе они встречаются в 80% наблюдений [51]. Перекрестные реакции наблюдаются при бластомикозах, коккцидиоидомикозе и паракоккцидиоидомикозе.

type: dkli00090

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Основу молекулярно-генетических методов составляет ПЦР и ее модификации. Принцип ПЦР заключается в многократном повторении (амплификации) исследуемых локусов нуклеиновых кислот термостабильной полимеразой для наработки достаточного количества ДНК и обнаружения ее методами электрофореза и гибридизации. Этот процесс достигается с помощью введения в реакционную смесь коротких молекул ДНК (праймеров), комплементарных нуклеотидным последовательностям того микроорганизма, который необходимо обнаружить. Связывание праймеров с соответствующими участками ДНК/РНК приводит к образованию локальной двухцепочечной структуры узнаваемой полимеразой, которая начинает достраивать ее в направлении 5- 3’, используя дезоксинуклеозидтрифосфаты, присутствующие в реакционной смеси. Таким образом, если один из праймеров связывается с прямой цепью, а другой с обратной, происходит наработка продукта, ограниченного с двух сторон этими праймерами. Поскольку каждый из вновь образованных продуктов - матрица для дальнейшей амплификации, происходит экспоненциальное увеличение их количества.

Анализ полученных продуктов амплификации с помощью электрофореза заключается в разделении ампликонов под действием электрического поля в агарозном или полиакриламидном геле. После окончания электрофореза оценивается наличие и размер полученных продуктов реакции амплификации. Гибридизация заключается в нанесении на твердую фазу (микропланшет) олигонуклеотидных зондов, комплементарных внутренней структуре исследуемых ампликонов (прямая гибридизация), или нанесении на твердую фазу полученных ампликонов (обратная гибридизация).

Добавление ампликонов или зондов, меченных либо с помощью радиоактивных меток, либо флюоресцентных, либо конъюгированных с ферментом, способным осуществлять цветовую реакцию (например, пероксидаза хрена), приводит к образованию комплексов, которые можно определять с помощью соответствующих методов. Достоинство гибридизации по сравнению с гель-электрофорезом - увеличение специфичности метода и объективизация оценки результатов эксперимента в автоматическом режиме. К недостаткам относится трудоемкость, необходимость использования специальной аппаратуры и более высокая стоимость.

Существуют наборы ПЦР для выявления отдельных микроорганизмов ( L. pneumophila, C. pneumoniae, M. pneumoniae, S. pneumoniae, M. tuberculosis, M. a vium, M. kansasii, H. capsulatum, B. dermatidis, C. immitis, A. fumigatus, P. jiroveci, T. gondii, респираторных вирусов, ВПГ, ЦМВ, ТОРС-коронавируса) и одновременного выявления нескольких возбудителей.